(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210900704.9 (22)申请日 2022.07.28 (71)申请人 河南中医药大学 地址 450046 河南省郑州市郑东 新区金水 东路156号 (72)发明人 赵珍珠　王真真　司盈盈　冯卫生　 纪宝玉　 (74)专利代理 机构 郑州天阳专利事务所(普通 合伙) 41113 专利代理师 聂孟民 (51)Int.Cl. C07J 9/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 灵芝中两个羊毛甾烷三萜化合物的制备方 法及其应用 (57)摘要 本发明涉及灵芝中两个羊毛甾烷三萜化合 物的制备方法及其应用， 可有效解决从灵芝中提 取羊毛甾烷三萜化合物1和羊毛甾烷三萜化合物 2， 实现在制备抗肿瘤活性药物中的应用， 开拓灵 芝药用价值和新用途的问题， 羊毛甾烷三萜化合 物1和羊毛甾烷三萜化合物2具有抗肿瘤活性， 可 有效用于制备治疗肿瘤的药物， 实现羊毛甾烷三 萜化合物1和羊毛甾烷三萜化合物2在制备抗肿 瘤活性药物中的应用。 本发明制备方法新颖独 特， 易操作， 原料丰富， 易生产制备， 从灵芝中制 备的羊毛甾烷三萜化合物1和羊毛甾烷三萜化合 物2具有抗肿瘤活性， 可有效用于制备抗肿瘤药 物， 开拓了灵芝的药用价值和商业价值， 开发应 用前景广阔， 经济和社会效益巨大。 权利要求书3页 说明书10页 附图4页 CN 115124584 A 2022.09.30 CN 115124584 A 1.一种灵芝中两个羊毛 甾烷三萜化合物的制备方法， 所述的两个羊毛 甾烷三萜化合物 分别是羊毛甾烷三萜化合物1((24E) ‑3,7,11‑trioxo‑lanosta‑8,24‑dien‑26‑ol)和羊毛 甾烷三萜化合物2((24E) ‑7α‑hydroxy‑3,11‑dioxo‑lanosta‑8,24‑dien‑26‑al)， 分子 结构 式分别为： 其制备方法是： (1)提取： 灵芝子实体9 ‑11kg粉碎， 加入体积浓度95％ 的工业乙醇浸没， 浸泡三天， 放出 乙醇， 得第一次乙醇浸 液； 药渣再加入体积浓度 95％乙醇浸没提取2次， 收集乙醇浸液； 合并 3次乙醇浸液， 减压浓 缩回收乙醇， 得乙醇提取物； (2)萃取： 加入乙醇提取物相同重量体积的乙酸乙酯， 重量体积是指乙醇提取物以kg 计， 液体以L计， 摇匀， 静置分层， 分取上层乙酸乙酯层， 下层水液继续和乙酸乙酯按照体积 比1︰ 1萃取， 如此萃取四次得总乙酸乙酯层， 总乙酸乙酯层减压浓缩除去乙酸乙酯， 得灵芝 子实体脂溶性 化合物的粗浸膏； (3)分离： 粗浸膏加入甲醇溶解， 用过200 ‑400目筛的正相硅胶600g吸附， 水浴锅恒温60 ℃挥干甲醇， 固体部分研磨成粉状； 取玻璃柱一根， 下端塞入棉花， 加入1800 ‑2200g正相硅胶， 再加入2800 ‑3200mL石油醚， 接着将吸附有样品的正相硅胶 装入该玻璃柱中， 石油醚 ‑丙酮梯度洗脱， 体积比10︰ 1洗脱9 ‑ 11L、 5︰ 1洗脱9 ‑11L、 2︰ 1洗脱9 ‑11L、 1︰ 1洗脱9 ‑11L， 每500mL接一瓶， 分别减压浓缩至溶剂挥 干， 用甲醇溶解， 用胶头滴管转移至 5mL的小瓶中； (4)点板显色合并： 将所有小瓶中的样品用毛细管在硅胶薄层板G254上点板， 在展开缸 中展开， 展开剂为体积比3︰ 2的石油醚 ‑丙酮5mL， 展开剂到顶端后取出晾干， 在254nm紫外灯 下观察化合物的荧光， 用香草醛 ‑硫酸‑乙醇液均匀喷洒硅胶板， 在电炉上加热显 色， 将相同 或类似的组分合并， 合并成5个组分， 即组分A、 组分B、 组分C、 组分D和组分E； 所述的香 草醛‑硫酸‑乙醇液是由15g香 草醛、 250mL乙醇、 2.5mL硫酸混匀制成； 组分C经中压液相色谱， 洗脱剂为体积比20︰ 80、 40︰ 60、 60︰ 40， 80︰ 20， 100︰ 0的甲醇/水， 每个梯度各冲5000mL， 流速 为35mL·min‑1， 每500mL接一瓶， 减 压浓缩至甲醇水挥干， 得干燥 物， 干燥物用甲醇溶解、 胶头滴管转移至5mL的小瓶中； 将所有小瓶中的样品用毛细管在硅 胶板G254上点板， 在 展开缸中展开， 展开剂为体积比3︰ 2的石油醚 ‑丙酮5mL， 展开剂 到顶端后 取出晾干， 在254nm紫外灯下观察化合物的荧光， 用香草醛 ‑硫酸‑乙醇液均匀喷洒硅胶板， 在电炉上加热显色， 将相同或类似的组分合并， 得2 2个组分， 即组分C1～C17、 C18～C2 2； 组分C17过LH ‑20甲醇凝胶柱， 甲醇洗脱12h， 流速0.5mL/min， 洗脱出来的甲醇每5mL为 一瓶， 甲醇洗脱液点板、 显色、 合并后减压浓 缩得6个组分， 即组分C17a ‑C17f； 组分C18过正相硅胶玻璃柱， 洗脱剂为体积比2︰ 1的石油醚 ‑丙酮， 等度洗脱， 点板显色， 减压浓缩得5个组分， 即组分C18a ‑C18e；权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115124584 A 2(5)纯化： 将组分C17a用甲醇溶解， 0.22 μm的滤膜过滤， 由半制备高效液相分离纯化， 条 件： Zorbax  SB‑C18柱子， 粒径5 μm， 规格9.4mm ×150mm， 流动相体积比45:55到65:35乙腈 ‑水 洗脱25min， 流速 为7mL·min‑1， 检测器是DAD光电二级阵列管检测器， 检测波长 为205、 220和 254nm， 在22.5分钟接峰， 为(24E) ‑7α‑hydroxy‑3,11‑dioxo‑lanosta‑8,24‑dien‑26‑al， 即 羊毛甾烷 三萜化合物2； 组分C18d用甲醇溶解， 0.22 μm的滤膜过滤， 由半制备高效液相分离纯化， 条件： Zorbax   SB‑C18柱子， 粒径5 μm， 规格9.4mm ×150mm， 流动相体积比45︰ 55到65︰ 40乙腈 ‑水洗脱20min， 流速为7mL ·min‑1， 检测器是DAD光电二级阵列管检测器， 检测波长为205、 220和254nm， 在 17.5分钟接峰， 为(24E) ‑3,7,11‑trioxo‑lanosta‑8,24‑dien‑26‑ol， 即羊毛甾烷三萜化合 物1。 2.根据权利要求1所述的灵芝中两个羊毛 甾烷三萜化合物的制备方法， 其特征在于， 包 括以下步骤： (1)提取： 灵芝子实体10kg粉碎， 置入不锈钢渗漉桶中， 加入体积浓度95％的工业乙醇 浸没， 浸泡三天， 放出乙醇， 得第一次乙醇浸液； 药渣再加入体积浓度95％乙醇浸没提取2 次， 收集乙醇浸液； 合并3次乙醇浸液， 减压浓 缩回收乙醇， 得乙醇提取物； (2)萃取： 乙醇提取物置入分液漏斗中， 加入相同重量体积的乙酸乙酯， 摇匀， 静置分 层， 分取上层乙酸乙酯层， 下层水液继续和乙酸乙酯按照体积比1︰ 1萃取， 如此萃取四次得 总乙酸乙酯层， 总乙酸乙酯层减压浓缩除去乙酸乙酯， 得灵芝子实体脂溶性化合物的粗浸 膏； (3)分离： 粗浸膏加入甲醇溶解， 用过200 ‑400目筛的正相硅胶600g吸附， 水浴锅恒温60 ℃挥干甲醇， 固体部分研磨成粉状； 取玻璃柱一根， 下端塞入棉花， 加入2000g正相硅胶， 再加入3000mL石油醚， 接着将吸附 有样品的正相硅胶装入该玻璃柱 中， 石油醚 ‑丙酮梯度洗脱， 体积比10︰ 1洗脱10L、 5︰ 1洗脱 10L、 2︰ 1洗脱10L、 1︰ 1洗脱10L， 每500mL接一瓶， 分别减压浓缩至溶剂挥干， 用甲醇溶解， 用 胶头滴管转移至 5mL的小瓶中； (4)点板显色合并： 将所有小瓶中的样品用毛细管在硅胶板G254上点板， 在展开缸中展 开， 展开剂为体积比3︰ 2的石油醚 ‑丙酮5mL， 展开剂到顶端后取出晾干， 在254nm紫外灯下观 察化合物的荧光， 用香草醛 ‑硫酸‑乙醇液均匀喷洒硅胶板， 在电炉上加热显 色， 将相同或类 似的组分合并， 合并成5个组分， 即组分A、 组分B、 组分C、 组分D和组分E； 组分C经中压液相色谱， 洗脱剂为体积比20︰ 80、 40︰ 60、 60︰ 40， 80︰ 20， 100︰ 0的甲醇/水， 每个梯度各冲5000mL， 流速 为35mL·min‑1， 每500mL接一瓶， 减 压浓缩至甲醇水挥干， 得干燥 物， 干燥物用甲醇溶解、 胶头滴管转移至5mL的小瓶中； 将所有小瓶中的样品用毛细管在硅 胶板G254上点板， 在 展开缸中展开， 展开剂为体积比3︰ 2的石油醚 ‑丙酮5mL， 展开剂 到顶端后 取出晾干， 在254nm紫外灯下观察化合物的荧光， 用香草醛 ‑硫酸‑乙醇液均匀喷洒硅胶板， 在电炉上加热显色， 将相同或类似的组分合并， 得2 2个组分， 即组分C1～C17、 C18～C2 2； 组分C17过LH ‑20甲醇凝胶柱， 甲醇洗脱12h， 流速0.5mL/min， 洗脱出来的甲醇每5mL为 一瓶， 甲醇洗脱液点板 显色合并后减压浓 缩得6个组分， 即组分C17a ‑C17f； 组分C18过正相硅胶玻璃柱， 洗脱剂为体积比2︰ 1的石油醚 ‑丙酮， 等度洗脱， 点板显色， 减压浓缩得5个组分， 即组分C18a ‑C18e；权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 115124584 A 3