ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/CVMA 364—2026 华支睾吸虫病诊断 技术 Diagnostic techniques for clonorchi asis 2026 - 4 - 1发布 2026 - 4 - 1实施 中国兽医协会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 364—2026 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由 吉林大学提出。 本文件由 中国兽医协会 归口。 本文件起草单位： 吉林大学、中山大学、中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 。 本文件主要起草人： 刘晓雷、刘明远、唐斌、白雪、王学林、丁静、李辰、金雪敏、徐凝、余新炳、 黄艳、洪炀 。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 364—2026 1 华支睾吸虫病 诊断技术 1 范围 本文件规定了华支睾吸虫囊蚴和虫卵的形态学和 PCR鉴定方法。 本文件适用于鱼类肌肉组织样品中华支睾吸虫囊蚴和哺乳动物粪便样品中华支睾吸虫虫卵的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp：碱基对（ base pair） DNA：脱氧核糖核酸（ deoxyribonucleic acid ） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（ deoxyribonucleoside triphosphate ） EB：溴化乙锭（ ethidium bromide ） PCR：聚合酶链式反应（ polymerase chain reaction ） TAE：三羟甲基氨基甲烷 -乙酸 -乙二胺四乙酸（ tris-acetate -EDTA） 5 形态学方法 5.1 器材 5.1.1 生物显微镜： 100×~ 400×。 5.1.2 体视显微镜。 5.1.3 离心机。 5.1.4 绞肉机。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 364—2026 2 5.1.5 37 ℃恒温箱。 5.1.6 磁力搅拌器、磁力搅拌子。 5.1.7 手术剪、镊子。 5.1.8 试管（ 10 mL）、橡皮塞。 5.1.9 微量可调移液器。 5.1.10 载玻片、盖玻片。 5.1.11 烧杯（ 1 L）。 5.1.12 尼龙绢（ 80目）。 5.1.13 塑料刮片。 5.1.14 塑料定量板：中央孔呈圆台形，短径 3 mm，长径 4 mm，高 1 mm，容积为 38.75 mm3。 5.1.15 亲水玻璃纸：规格为 40 μm厚，裁剪成 25 mm×40 mm大小，使用前在透明液中浸泡 24 h以 上，至玻璃纸呈现绿色。 5.2 试剂 5.2.1 盐酸溶液： 36 % HCl溶液。 5.2.2 生理盐水： 0.9 % NaCl溶液。 5.2.3 透明液：由纯甘油 100 mL、3%孔雀绿（或亚甲基蓝）水溶液 1 mL和蒸馏水 100 mL配制而成。 5.2.4 乙醚。 5.2.5 胃蛋白酶（ 1:3000）。 5.2.6 胃蛋白酶消化液。 5.3 压片法 5.3.1 样品制备 将待检的淡水鱼清洗干净，去除体表 黏液，用剪刀挑开 鱼背部皮肤，从皮下剪取 2份~ 3份黄豆粒 大小的鱼肉，放在两张载玻片之间，用力将鱼肉压薄 ，将载玻片两端用细线扎紧 。 5.3.2 镜检 将玻片置于生物显微镜 （放大倍数 4×10或10×10）下观察有无华支睾吸虫囊蚴 。 5.3.3 结果判定 显微镜下 观察到符合附录 A中图 A.1特征的华支睾吸虫 囊蚴，可判定为华支睾吸虫 感染。 5.4 消化法 5.4.1 样品制备 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 364—2026 3 取待检的淡水鱼 的肌肉组织 ，清洗干净，用剪刀剪碎或用绞肉机低速搅碎。 5.4.2 消化 取样品 100 g置于 1 L烧杯中，加入 1 L胃蛋白酶消化液（见附录 B的B.1），搅拌均匀，放入磁力搅 拌子，于 37 ℃恒温箱内用磁力搅拌器进行搅拌消化，直至鱼肉完全消化为止。可根据不同种类的鱼以 及胃蛋白酶活力和使用量适当调整消化时间。 5.4.3 镜检 消化液静置，弃去上层液体，取全部沉淀物至玻璃平皿， 在体视显微镜下去除沉淀中的杂质，分离、 收集疑似囊蚴，用生物显微镜观察。 5.4.4 结果判定 显微镜下观察到符合附录 A中图A.1特征的华支睾吸虫囊蚴，可判定为华支睾吸虫感染。 5.5 直接涂片法 5.5.1 取样 在载玻片中央滴加生理盐水或清水 1滴 ~ 2滴，用干净竹签挑取少量粪便样品与水滴充分调和，剔 除大的粪渣，涂布均匀，涂面大小约为 1.5 cm×2.5 cm，涂布成能透过其看到纸上字迹的薄层为宜。检 测的粪便应该是新鲜的粪便，如果不能立即检测，可先置于 4 ℃环境。 5.5.2 镜检 每份标本应涂片三张，在生物显微镜下仔细查找虫卵，并将三张涂片全部检查完毕。 5.5.3 结果判定 显微镜下观察到符合 附录 A中图A.2特征的华支睾吸虫虫卵，可判定为华支睾吸虫感染。 5.6 改良加藤厚涂法 5.6.1 取样 取1 g ~ 2 g新鲜粪便，将一块尼龙绢覆盖于粪便样本上，用塑料刮片轻刮尼龙绢，将刮取的粪便置 于载玻片上的塑料定量板中央，用刮板将粪便填满中央孔内并抹平。取下定量板，将亲水玻璃纸盖在粪 便上，用载玻片轻压，使粪便均匀展开至玻璃纸边缘，至粪膜变透明，透明时间不宜超过 2 h。 5.6.2 镜检 用生物显微镜进行 检查整张涂片。 5.6.3 结果判定 显微镜下观察 到符合附录 A中图 A.2特征的华支睾吸虫虫卵 ，可判定为华支睾吸虫 感染。 5.7 盐酸乙醚离心沉淀法 5.7.1 取样 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 364—2026 4 称取 1 g粪便放入试管中，加 入盐酸溶液 4 mL，混匀，用镊子挑去大块粪渣，用橡皮塞塞紧管口， 摇匀后静置 3 min ~ 5 min，再加入乙醚 2 mL，塞紧橡皮塞 ，摇匀， 1000 r/min ~ 1500 r/min离心 3 min ~ 5 min。管内分为 四层，即从上至下分别为 乙醚、粪便层、盐酸及细粪渣和虫卵沉淀物 ，弃去上层，仅保 留虫卵沉淀物。 5.7.2 镜检 取虫卵沉淀物置于载玻片上，直接镜检或加盖玻片后镜检 。 5.7.3 结果判定 显微镜下观察到符合附录 A中图 A.2特征的华支睾吸虫虫卵，可判定为华支睾吸虫感染。 6 PCR方法 6.1 器材 6.1.1 PCR仪。 6.1.2 高速离心机。 6.1.3 恒温水浴锅。 6.1.4 电泳仪。 6.1.5 凝胶成像系统。 6.1.6 微量可调移液器。 6.1.7 无DNA酶污染的离心管。 6.1.8 PCR反应管。 6.1.9 无DNA酶污染的吸头。 6.2 试剂 6.2.1 10×PCR缓冲液。 6.2.2 Ex Taq酶： 5 U/μL。 6.2.3 dNTP预混液： 2.5 mmol /L。 6.2.4 MgCl 2：25 mmol /L。 6.2.5 电泳缓冲液： l×TAE缓冲液（见附录 B.2）。 6.2.6 普通核酸电泳用琼脂糖。 6.2.7 电泳加样缓冲液（见附录 B.3）。 6.2.8 DNA分子质量标准：分子大小范围包含 750 bp ~ 1000 bp。 6.2.9 10 mg/mL 溴化乙锭或其他核酸染料。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台